Procedura di colorazione di Gram in microbiologia

La colorazione di Gram è un metodo di colorazione differenziale utilizzato per assegnare i batteri a uno dei due gruppi (gram-positivi e gram-negativi) in base alle proprietà delle loro pareti cellulari. È anche noto come colorazione di Gram o metodo di Gram. La procedura prende il nome dalla persona che ha sviluppato la tecnica, il batteriologo danese Hans Christian Gram.

Come funziona la colorazione di Gram

La procedura si basa sulla reazione tra il peptidoglicano nelle pareti cellulari di alcuni batteri. La colorazione di Gram prevede la colorazione dei batteri, il fissaggio del colore con un mordente, la decolorazione delle cellule e l’applicazione di una controcolorazione.

  1. La macchia primaria (violetto cristallino) si lega al peptidoglicano, colorando le cellule in viola. Sia le cellule gram-positive che quelle gram-negative hanno peptidoglicano nelle loro pareti cellulari, quindi inizialmente tutti i batteri si colorano di viola.
  2. Lo iodio di Gram (iodio e ioduro di potassio) viene applicato come mordente o fissativo. Le cellule Gram-positive formano un complesso cristallo violetto-iodio.
  3. L’alcol o l’acetone vengono utilizzati per decolorare le cellule. I batteri gram-negativi hanno molto meno peptidoglicano nelle loro pareti cellulari, quindi questo passaggio li rende essenzialmente incolori, mentre solo una parte del colore viene rimossa dalle cellule gram-positive, che hanno più peptidoglicano (60-90% della parete cellulare). La spessa parete cellulare delle cellule gram-positive viene disidratata durante la fase di decolorazione, facendole restringere e intrappolando il complesso colorante-iodio all’interno.
  4. Dopo la fase di decolorazione, viene applicata una controcolorazione (solitamente safranina, ma a volte fucsina) per colorare i batteri di rosa. Sia i batteri gram-positivi che quelli gram-negativi raccolgono la macchia rosa, ma non è visibile sul viola più scuro dei batteri gram-positivi. Se la procedura di colorazione viene eseguita correttamente, i batteri gram-positivi saranno viola, mentre i batteri gram-negativi saranno rosa.

Scopo della tecnica di colorazione di Gram

I risultati della colorazione di Gram vengono visualizzati mediante microscopia ottica. Poiché i batteri sono colorati, non solo viene identificato il loro gruppo di colorazione Gram, ma è possibile osservare la loro forma, dimensione e pattern di aggregazione. Ciò rende la colorazione di Gram un prezioso strumento diagnostico per una clinica o un laboratorio medico. Sebbene la macchia possa non identificare definitivamente i batteri, spesso sapere se sono gram-positivi o gram-negativi è sufficiente per prescrivere un antibiotico efficace.

Limitazioni della tecnica

Alcuni batteri possono essere gram-variabili o gram-indeterminati. Tuttavia, anche questa informazione può essere utile per restringere l’identità batterica. La tecnica è più affidabile quando le colture hanno meno di 24 ore. Sebbene possa essere utilizzato su colture di brodo, è meglio centrifugarle prima. La limitazione principale della tecnica è che produce risultati errati se vengono commessi errori nella tecnica. Sono necessarie pratica e abilità per produrre un risultato affidabile. Inoltre, un agente infettivo potrebbe non essere batterico. I patogeni eucariotici si colorano di gram-negativi. Tuttavia, la maggior parte delle cellule eucariotiche, ad eccezione dei funghi (incluso il lievito), non si attaccano al vetrino durante il processo.

Procedura di colorazione di Gram

Materiali

  • Violetto cristallino (macchia primaria)
  • Gram’s iodio (mordente, per fissare il violetto cristallino nella parete cellulare)
  • Etanolo o acetone (decolorante)
  • Safranina (colorante secondario o controcolorante)
  • Acqua in un flacone a spruzzo o in un flacone contagocce
  • Vetrini per microscopio
  • Microscopio composto

Passi

  1. Posizionare una piccola goccia di campione batterico su un vetrino. Il calore fissa i batteri al vetrino facendolo passare tre volte attraverso la fiamma di un becco Bunsen. Applicare troppo calore o troppo a lungo può sciogliere le pareti cellulari dei batteri, distorcendone la forma e portando a un risultato impreciso. Se viene applicato troppo poco calore, i batteri laveranno via dal vetrino durante la colorazione.
  2. Utilizzare un contagocce per applicare il colorante primario (viola cristallino) al vetrino e lasciarlo riposare per 1 minuto. Risciacquare delicatamente il vetrino con acqua per non più di 5 secondi per rimuovere la macchia in eccesso. Risciacquare troppo a lungo può rimuovere troppo colore, mentre non risciacquare abbastanza a lungo può lasciare che troppa macchia rimanga sulle cellule gram-negative.
  3. Usa un contagocce per applicare lo iodio di Gram sul vetrino per fissare il violetto di cristallo alla parete cellulare. Lascia riposare per 1 minuto.
  4. Risciacquare il vetrino con alcool o acetone per circa 3 secondi, seguito immediatamente da un risciacquo delicato con acqua. Le cellule gram-negative perderanno colore, mentre le cellule gram-positive rimarranno viola o blu. Tuttavia, se il decolorante viene lasciato acceso troppo a lungo, tutte le cellule perderanno colore!
  5. Applicare la macchia secondaria, safranina, e lasciarla riposare per 1 minuto. Risciacquare delicatamente con acqua per non più di 5 secondi. Le cellule gram-negative dovrebbero essere colorate di rosso o rosa, mentre le cellule gram-positive appariranno ancora viola o blu.
  6. Visualizza la diapositiva utilizzando un microscopio composto. Potrebbe essere necessario un ingrandimento da 500x a 1000x per distinguere la forma e la disposizione delle cellule.

Esempi di patogeni Gram-positivi e Gram-negativi

Non tutti i batteri identificati dalla colorazione di Gram sono associati a malattie, ma alcuni esempi importanti includono:

  • Cocchi Gram-positivi (rotondi): Staphylococcus aureus
  • Cocchi Gram-negativi: Neisseria meningitidis
  • Bacilli Gram-positivi (bastoncelli): Bacillus anthracis
  • Bacilli Gram-negativi: Escherichia coli